0935-2608482

　　P。 aeruginosa培育48 h后，通过结晶紫染色测定添加沉组纤维素酶CelL7和CelL7-CBM3后残留的未分离生物膜量，取对照组比拟，质量浓度为10。0～60。0 μg/mL的沉组酶CelL7和30。0～60。0 μg/mL的CelL7-CBM3对P。 aeruginosa生物膜具有显著的分离感化（P＜0。001），同时5。0 μg/mL的CelL7较对照组具有必然的分离感化（P＜0。01），而5。0 μg/mL和10。0 μg/mL的CelL7-CBM3不克不及无效分离P。 aeruginosa生物膜。不异质量浓度下沉组酶CelL7较融合酶CelL7-CBM3对P。 aeruginosa分离结果更好。因而，沉组酶CelL7和CelL7-CBM3能够无效分离铜绿假单胞菌生物膜。有研究表白发展正在生物膜中的微生物细胞匹敌生素和宿从免疫反映的耐受性是浮逛细胞的1 000 倍。纤维素酶对细菌生物膜的降解可能是因为多糖的水解和生物膜布局的，从而添加了浮逛细胞的扩散。Kamali等研究发觉1。25、2。5、5。0 U/mL和10。0 U/mL的纤维素酶取头孢他啶联用能够导致铜绿假单胞菌生物膜显著削减。

　　酶学性质研究成果表白，CelL7取CelL7-CBM3的最适反映温度根基分歧，均为50 ℃。温度正在40～55 ℃范畴内时，CelL7能维持较高的酶活力，具有较好的热不变性，表白CelL7是一种中温纤维素酶。CelL7取CelL7-CBM3的最适pH值别离为5。0和5。5，CelL7正在pH值为4。0～6。5的范畴内相对酶活力均维持正在80%以上，而CelL7-CBM3正在pH值为4。0～8。0的范畴内相对酶活力可以或许维持正在80%以上，具有较好的pH值不变性。Mn2+和Fe2+能激活CelL7活力，5。0 mmol/L和10。0 mmol/L的Cu2+对CelL7活力有较着的感化。底物性成果显示，CelL7可降解CMC-Na、纤维二糖和木聚糖，表白CelL7次要感化于。

　　生物膜断根尝试表白，5。0～60。0 μg/mL的CelL7和CelL7-CBM3可以或许无效分离生物膜，削减生物膜量。因而，沉组酶CelL7和CelL7-CBM3能够无效分离铜绿假单胞菌生物膜，具有做为酶制剂断根生物膜使用于食物平安加工的潜力。

　　如图4A所示，CelL7正在pH 5。0时酶活力最高，此中正在pH 3。5～7。5范畴内相对酶活力均维持正在80%以上，表白CelL7是一种嗜酸性酶。融合酶CelL7-CBM3取CelL7的最适反映pH值附近，正在pH 5。5时达到最高酶活力，而正在pH 8。0～11。0的碱性前提下反映酶活力均下降至60%以下，表白该酶适合正在酸性下反映。这取来自糖苷GH5的沉组纤维素酶CMC-1水解羧甲基纤维素的成果类似，其正在pH 5。0和50 ℃时具有最大活性。研究表白海洋纤维素酶最适反映pH值正在4。5～8。0范畴内，正在弱酸性范畴内具有最大活性。源海洋芽孢杆菌属细菌排泄的耐盐纤维素酶Bc22Cel的最佳pH值和温度别离为6。5和60 ℃。

　　拔取CMC-Na、纤维二糖、Avicel、木聚糖、昆布多糖、葡聚糖、壳聚糖和麦芽糖做为反映底物，研究CelL7的底物性。如图6所示，CelL7对CMC-Na、纤维二糖和木聚糖均表示出必然的水解能力，而对结晶性纤维素Avicel、昆布多糖、葡聚糖、壳聚糖和麦芽糖无较着降解感化，表白CelL7次要水解。

　　如图8所示，将抗药金葡萄球菌培育48 h后，通过结晶紫染色法测定添加沉组纤维素酶CelL7和CelL7-CBM3后残留的未分离生物膜量，取对照组比拟，质量浓度为5。0～60。0 μg/mL的CelL7和10。0～60。0 μg/mL的CelL7-CBM3对S。

　　通过DNS法测定酶活性，沉组纤维素酶CelL7和CelL7-CBM3的比酶活力别离为2 249。81 U/mg和2 915。75 U/mg，融合了CBM3连系布局域后比活力提高了0。3 倍。研究表白，CBM布局域次要阐扬3 种感化：将酶靶向底物、添加酶取底物的接近性、结晶型底物有必然的感化。CBM布局域的焦点感化正在于识别并性地取不溶性纤维素进行连系，这种连系将纤维素酶的CD指导至纤维素底物，从而加强了纤维素酶对底物的亲核性以及水解活性。CBM布局域可以或许取纤维素葡萄糖单位概况临齐，该连系可能是由氨基酸侧链和取多糖概况的骨架位点之间的氢键驱动，可以或许使得纤维素酶可以或许愈加慎密地取底物连系，提拔了底物上的无效酶浓度，推进酶-底物的彼此感化，从而显著提高催化效率。Li Xiangqian等将内切葡聚糖酶基因！

　　Endo5、融合酶Endo5-2CBM-Exo5对微晶纤维素的比活力比亲本CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28提高了2。2～14。0 倍，正在85 ℃孵育2 h后融合酶的相对活性连结正在45%～68%，表示出较好的热不变性。

　　aureus生物膜具有显著的分离感化（P＜0。001），两种沉组纤维素酶对于生物膜的分离结果均跟着质量浓度的添加而添加，但不异质量浓度下沉组酶CelL7较融合酶CelL7-CBM3的分离结果更好。

　　表2为以CMC-Na为底物时CelL7和CelL7-CBM3的比活力及动力学参数。不异的酶活力单元定义下，CelL7-CBM3对CMC-Na的比活力为2 915。76 U/mg，比拟原酶的2 249。81 U/mg有所提高。分析上述的阐发成果，可知添加连系布局域能提高沉组融合酶对底物的催化感化。

　　生物膜断根手艺正在食物酶学中的使用是一个主要的研究范畴，由于生物膜的构成可能导致食物污染和食物平安问题。保守的化学消毒方式比拟，酶制剂凡是更环保，且不易导致微生物发生抗性，是一种绿色平安的生物膜断根方式，可以或许提高食物加工的效率和经济效益。

　　CelL7（图1A）取CelL7-CBM3（图1B）条带大小合适预期且单一。经SDS-PAGE阐发，CelL7卵白条带显示取预测的理化卵白质量40。39 kDa成果分歧，融合卵白CelL7-CBM3的大小为50 kDa摆布（图2）。

　　纤维素酶是一类能催化水解纤维素生成葡萄糖的复合酶，属于糖苷水解酶（GH）类，正在食物、生物燃料以及生物医药等范畴阐扬着主要感化，它能催化水解纤维素生成葡萄糖、纤维二糖和纤维素低聚糖，属于GH家族。GH5家族做为最大的GH家族之一，属于GH-A家族，其催化布局域（CD）因具有典型的！

　　如图5所示，1。0、5。0 mmol/L和10。0 mmol/L的Mn2+以及10。0 mmol/L的Fe2+对CelL7活力有较着的激活感化，相对酶活力可提高30%摆布；同时1。0 mmol/L的Fe2+、Li+对CelL7的催化过程有微弱的推进感化，而Mg2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+对CelL7活力表示出分歧程度的感化，概况活性剂SDS和EDTA对CelL7的活力也呈现雷同的纪律，而且跟着离子浓度的添加程度逐步增大，此中Cu2+的存正在对CelL7的活力感化最为较着，正在Cu2+浓度为5。0 mmol/L和10。0 mmol/L时完全CelL7活力。成果表白CelL7不属于金属卵白，插手微量Mn2+、Fe2+和Li+能够提高其活力。雷同的成果也呈现正在曲霉ZJUBE-1菌株纯化的纤维素酶，其正在Fe2+和Mn2+的存鄙人活力显著加强，而Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Ag2+、Hg2+和EDTA则了纤维素酶活力；有所分歧的是，来历于。

　　纤维素酶是一类能催化水解纤维素生成葡萄糖的复合酶，属于GH类，正在食物、制纸制浆、生物燃料以及生物医药等范畴阐扬着主要感化。本研究从海洋细菌。

　　-1，4-糖苷键，不克不及感化于-1，3-1，4-糖苷键、-1，3或-1，6糖苷键，对于微晶纤维素Avicel感化弱也表白其不克不及感化于-糖苷键。由此可见沉组纤维素酶CelL7具有内切葡聚糖酶和-葡聚糖酶活性，而无外切葡聚糖酶活性。来自GH5家族的沉组纤维素酶KG51同样表示出对-1，4-糖苷键的活性，对CMC、-甘露聚糖和山毛榉木聚糖的酶活性高于-1，3-1，4-糖苷键、-1，3或-1，6糖苷键的底物的酶活性。然而同属统一家族的酶也具有分歧的底物性，从Thermobifida albaAHK119中克隆表达的内切葡聚糖酶AHK119-E5对不溶性纤维素底物的活性高于对可溶性纤维素底物的活性，这取其CD和CBM的氨基酸序列有必然联系。

　　如图3所示，以CMC-Na为底物反映，CelL7取CelL7-CBM3正在50 ℃时表示出最高酶活力。正在40～55 ℃孵育1 h后，CelL7可连结正在80%以上的相对酶活力；跟着温度上升，CelL7的热不变性逐步下降；正在60 ℃孵育1 h后，CelL7的相对酶活力降至20%以下。由此可见当温度正在40～55 ℃范畴内时，CelL7能维持较高的活力，具有较好的热不变性，表白CelL7是一种中温纤维素酶。将CelL7-CBM3于40～55 ℃孵育45 min后，仍连结80%的初始酶活力。取CelL7比拟，正在C结尾添加连系布局域后的融合酶CelL7-CBM3正在分歧温度下的热不变性差别不大。有研究表白纤维素酶的最适反映温度范畴为40～55 ℃，源于！

　　β/α） 8 -TIM桶状折叠布局也被认为属于4/7超家族，具有双置换保留型催化机制，该机制涉及两种催化残基，凡是是谷氨酸或天冬氨酸残基，一种做为催化酸、碱，另一种做为亲核试剂。基于CBMs的功能特点，将分歧来历的CBMs取纤维素酶的CD融合沉组以开辟嵌合酶是改善酶的水解效率的一种无效手段。

　　纤维素酶的多种使用需要寻找新的酶来历，比拟陆地来历，如超热不变性、高耐盐性、耐压性和寒冷顺应性等。